口服给药具有无创性，是一种理想的给药途径，但对于许多类型的化合物仍不可行。如果靶点在肠道内，该药物必须能够在上消化道（GIT）的酸性和蛋白水解条件下生存，并可能被微生物蛋白酶降解。这使得口服生物药物具有挑战性。
噬菌体（phages）是一种原核病毒，以在感染过程中将宿主机制导向噬菌体编码基因的表达而闻名。本研究提出一个假设，即一种治疗性蛋白可以被编码到一个毒性噬菌体中，从而在一个常驻肠道细菌感染过程中与噬菌体基因共表达，然后通过噬菌体诱导的细胞裂解释放到细胞外。此外，还假设噬菌体-细菌的共存将导致噬菌体编码基因的持续产生。
在此，弗吉尼亚理工学院Bryan B. Hsu和Liwu Li证明了基因工程毒性可以用来重新编程细菌来表达和释放治疗性蛋白。相关研究内容以“Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage”为题发表在《Nature Biotechnology》。首先，本研究证明了当超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）基因在宿主细菌和噬菌体的基因组中被编码时，强毒性噬菌体T4将大量细胞内产生的荧光标记蛋白sfGFP释放到培养裂解液中。然后，通过小鼠模型表明，单剂量编码sfGFP基因的噬菌体可以在小鼠黏膜中大量原位产生sfGFP。最后，在两个小鼠模型中证明了本研究提出的方法的可行性。
在第一个模型中，使用T4噬菌体表达丝氨酸蛋白酶抑制剂B1a（serpin B1a）蛋白抑制促炎酶中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的活性，该酶在结肠炎过程中上调。在第二个模型中，使用T4噬菌体表达蛋白ClpB，蛋白ClpB具有一个不连续的5个氨基酸基序，与厌食神经肽α-促黑激素（α-MSH）同源，可以诱导饱腹感以减少肥胖期间的体重增加。研究发现，在饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型中，设计表达ClpB的T4噬菌体可以减少体重增加。总之，本研究表明，毒性噬菌体可以用来表达和释放对哺乳动物宿主具有生理作用的异源蛋白。
研究内容
如图1a所示，假设细菌被一个强毒性噬菌体感染会使细胞内蛋白释放到细胞外环境中。将T4噬菌体与表达sfGFP基因的大肠杆菌K-12菌株孵育。在后文中用“sfgfp”表示该基因，用“sfGFP”表示sfgfp基因的蛋白产物。如图1b所示，与不含噬菌体培养的细菌（~7×103 AU/OD）相比，含T4噬菌体的荧光大肠杆菌培养物在上清液中每个细胞有更多的荧光（~0.5-1.0×106AU/OD）。以上数据表明T4噬菌体促进细胞内蛋白释放到细胞外。
图1 噬菌体诱导的细菌裂解释放细胞内蛋白质
接下来量化在细菌细胞感染过程中是否可以产生并释放大量噬菌体编码的异源蛋白。早期T4噬菌体启动子转录优于宿主启动子，部分原因是前者启动子强度更大，宿主RNA聚合酶修饰优先转录T4启动子。这最终导致噬菌体启动子在连续阶段的转录（图2a），以优化活病毒颗粒的组装。本研究生成一个重组T4噬菌体小文库，其中包含驱动sfgfp基因表达的选定启动子（图2b），并将该结构插入一个已用于T4重组的非必要假设膜蛋白（ac基因）中。在大肠杆菌K-12中培养12 h后，用荧光法测定上清液中释放的sfGFP蛋白。与缺乏sfgfp基因的非工程T4噬菌体（野生型）相比，缺乏启动子（无启动子）或使用强组成型大肠杆菌启动子（J23119）并没有导致更多的sfGFP荧光（图2c）。与野生型T4噬菌体相比，编码这些启动子的噬菌体滴度降低大约两倍，但没有统计学意义（图2d）。基于最大sfGFP水平和对噬菌体滴度影响最小的标准，在接下来的实验中使用gp22启动子。
图2 T4噬菌体启动子对体外生产sfGFP的研究
如图3a所示，在饮用水中提供链霉素，用单剂量的大肠杆菌定植，然后给予野生型T4噬菌体或T4：：sfgfp噬菌体。细菌和噬菌体共定植4天后，发现两者都大量存在（图3b）。荧光显微镜对未固定肠切片黏膜的荧光定量显示，T4：：sfgfp噬菌体定植的小鼠比野生型T4噬菌体定植的小鼠的GFP荧光显著增加（图3c）。由于自身荧光，野生型T4噬菌体具有低水平荧光，而T4：：sfgfp噬菌体具有大量粘膜荧光（图3d、e）。为进一步验证GFP荧光定位于粘膜，固定肠道样本，用WGA和UEA I对DAPI和粘蛋白进行染色。结果显示，野生型T4噬菌体定植小鼠黏膜中的FITC通道荧光与组织的自身荧光相比没有明显变化（图3f）。在更高的放大倍数下，通道分离（图3g-j）。相比之下，用T4：：sfgfp噬菌体定植的小鼠有大量的黏膜GFP荧光（图3k）。更高的放大倍数（图3l）证实GFP荧光（图3m）增加，共定位于组织管腔侧的粘膜（图3n），远离细胞核（图3o）。综上结果表明，由噬菌体特异性启动子驱动的异源基因在噬菌体繁殖过程中可以大量表达。
图3 通过工程噬菌体在体内产生sfGFP
为了检测T4：：serpin噬菌体产生的serpin在哺乳动物肠道中的有效性，使用化学诱导的结肠炎小鼠模型（图4a）。如图4b、c所示，粪便中的大肠杆菌和噬菌体水平在实验期间持续存在，而野生型T4和T4：：serpin之间没有显著差异。第9天T4：：serpin处理的小鼠体重显著增加（图4d），且粪便NE活性显著降低（图4e）。对结肠中性粒细胞的分析显示，不同噬菌体条件下的中性粒细胞密度相似（图4f），但来自T4：：serpin处理小鼠的中性粒细胞富含CD24标记物（图4g）。
图4 通过Serpin的产生减弱DSS诱导的结肠炎
为了确定基于噬菌体方法原位产生ClpB是否会对宿主产生生理相关的影响，使用如图5a所示的DIO小鼠模型。粪便噬菌体滴度显示，野生型T4和T4：：clpB噬菌体均能在小鼠肠道中保持定植（图5b）。尽管引入了野生型T4或T4：：clpB噬菌体（图5c），粪便大肠杆菌浓度也显示出持续的定植（图5c），突出噬菌体和细菌之间的共存。为深入了解观察到的噬菌体和细菌共存的潜在机制，将粪便大肠杆菌菌落与噬菌体进行交叉杂交，以确定噬菌体抗性的频率。如图5d、e所示，与野生型T4培养的大肠杆菌相比，T4：：clpB噬菌体培养的大肠杆菌中抗α-MSH抗体的标记更明显。抗α-MSH抗体通过交叉反应与ClpB结合。在本实验过程中，与没有噬菌体或野生型T4噬菌体定植的小鼠相比，有T4：：clpB噬菌体定植的小鼠体重显著降低（图5h）。用T4：：clpB噬菌体定植小鼠的食物消耗量减少（图5I），这与夜间活动增加有关（图5j）。DIO在小鼠模型中导致炎症。与野生型T4噬菌体相比，T4：：clpB噬菌体定植的小鼠中的几种促炎细胞因子减少，例如IL-1α和IL-1β。其他细胞因子也有所减少，包括单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、IL-17A和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），但未达到统计学意义（图5k）。
图5 T4：：clpB对减少食物消耗和体重增加的功效
小结
综上所述，本研究表明在正常的噬菌体感染过程中，工程毒性噬菌体T4可以利用与细菌宿主的共存产生持续的原位效应，协调哺乳动物肠道中异源蛋白的产生和释放。通过工程T4噬菌体在晚期T4噬菌体启动子gp22下表达sfgfp，发现该报告蛋白在体内和体外均显著表达。T4产生的蛋白酶抑制剂serpin B1a可以降低结肠炎期间小鼠肠道中的NE活性。最后，研究发现ClpB蛋白的表达可以显著减少DIO小鼠模型中的体重增加。总之，本研究是一个概念证明的验证，即工程毒性噬菌体可以用于原位生产异源蛋白。
参考文献：Baker, Z.R., Zhang, Y., Zhang, H. et al. Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02570-7
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